1. EUROLine Western Blot : Principe du test

2. Réalisation

3. Evaluation

4. Mode Opératoire (entièrement automatisable)


 

EUROLine Western Blot : Principe du test

• Des bandelettes contenant des extraits antigéniques séparés par électrophorèse sont utilisées comme phase solide. La position des protéines dépend de leur poids moléculaire respectif.

• Si l'échantillon est positif, les anticorps spécifiques contenus dans l'échantillon de sérum dilué se lient aux antigènes fixés à la membrane.

• Dans une seconde étape, les anticorps liés sont détectés avec des anticorps anti-immunoglobulines humaines couplés à la phosphatase alcaline (PAL).

• Dans une troisième étape, les anticorps liés sont rendus visibles en utilisant une solution chromogène/substrat, qui en présence de l'enzyme, est capable de générer une réaction colorée. Si l'échantillon de sérum contient les anticorps spécifiques, une bande sombre intense apparaît au niveau de la ligne de l'antigène correspondant.

• L'évaluation des bandes sur la bandelette de membrane incubée nécessite une différenciation des anticorps spécifiques des anticorps non spécifiques. Le nombre et l'intensité des bandes spécifiques sont décisifs pour la qualification des résultats "positif/négatif".

• Les anticorps dirigés contre tous les antigènes sont analysés simultanément en un test.

• La technique EUROLINE WESTERN BLOT peut être automatisée facilement avec EasyBlot, EUROBlotMaster et EUROBlotOne. La lecture et parfois l'interprétation peuvent être réalisées grâce au logiciel EUROLineScan.






Réalisation
   
   
EUROLine Western Blot Borrelia
Exemple : EUROLine Western Blot Borrelia

• Réactifs prêts à l'emploi (sauf tampon universel concentré utilisé pour diluer les échantillons et pour le lavage).

• Avant la 1ère incubation, les bandelettes sont incubées 15 min dans du tampon universel.

• Temps d'incubation total : 115 min.

• La chambre d'incubation est incluse dans chaque coffret.

• Incubations à température ambiante sur agitateur à bascule.

• Chaque coffret contient une bandelette incubée avec un sérum positif de référence. Ainsi, l'incubation d'un sérum de contrôle positif n'est pas nécessaire.

• Les bandelettes sont numérotées pour éviter toute confusion.

• Une réalisation de toutes les étapes est validée par l'apparition d'une bande en bas de la bandelette.

• Le titre est corrélé à l'intensité de la coloration de la bande.

Evaluation


Les résultats sont évalués à l'œil nu, à l'aide d'un protocole d'évaluation (lot dépendant) précisant l'emplacement et l'antigène correspondant à chaque bande. La lecture peut aussi être automatisée en utilisant le logiciel EUROLineScan.

Le logiciel EUROLineScan a été développé afin de permettre l'évaluation des bandelettes EUROLINE Western Blot. Il facilite la gestion des données, et fourni une documentation détaillée des résultats. Dans un premier temps les bandelettes EUROLINE Western Blot sont scannées à l'aide d'un scanner de bureau. L'EUROLineScan reconnaît la position des bandelettes, même si elles ont été incorrectement positionnées, identifie les bandes, et mesure leur intensité. Les résultats sont alors sauvegardés avec les images. Une feuille de résultats séparée peut être éditée pour chaque patient.






Mode opératoire automatisable
1
Pipeter
1,5 ml par rigole
Tampon échantillon
Incuber
5 minutes avec agitation sur un agitateur à bascule
 
Pipeter
Vider par aspiration
 
2
Pipeter
1,5 ml par rigole
Echantillons dilués dans le tampon échantillon
Incuber
30 minutes avec agitation sur un agitateur à bascule
 
Laver (x 3)
1,5 ml de tampon
5 minutes d'incubation
Vider la rigole par aspiration
Tampon de lavage
3
Pipeter
1,5 ml par rigole
Conjugué enzymatique
Incuber
30 minutes avec agitation sur un agitateur à bascule
 
Laver (x 3)
1,5 ml de tampon
5 minutes d'incubation
Vider la rigole par aspiration
Tampon de lavage
4
Pipeter
1,5 ml par rigole
Solution chromogène / substrat
Incuber
10 minutes avec agitation sur un agitateur à bascule
 
Laver (x 3)
Rincer avec de l'eau distillée
Vider la rigole par aspiration
Eau distillée
5
Evaluer
Analyse visuelle ou automatisée (EUROLineScan) des bandes
 

 

 

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