Immuno-Fluorescence Indirecte : Principe du test
   
Schéma du principe du test d'immunofluorescence indirecte représentant un anticorps humain spécifique attaché à une cellule et à l'isothiocyanate de fluorescéine • Des cellules infectées ou non, des tissus ou des substances purifiées, biochimiquement caractérisés, sont utilisés comme substrats antigéniques.

• Si l'échantillon est positif, les anticorps spécifiques présents dans l'échantillon de sérum dilué se lient aux antigènes fixés à la phase solide (BIOCHIP).

• Dans une seconde étape, les anticorps liés sont détectés avec des anticorps anti-humain couplés à la fluorescéine et analysés avec un microscope à fluorescence.

• Les échantillons positifs peuvent être titrés en plusieurs étapes de dilutions. L'intervalle de titration le plus adapté est obtenu avec le facteur de dilution 3.162 (racine carrée de 10). De cette manière, toute seconde étape de dilution représente dans son dénominateur une puissance de 10 (1:10, 1:32, 1:100, 1:320, 1:1000, 1:3200, 1:10000 etc.). D'autres méthodes de dilutions peuvent également être utilisées (1 :80 ; 1 :160,…).

 

Standardisation et Modernisation de l'IFI
   
Schéma explication du système de mosaïque • Technique d'Activation: des lamelles couvre-objet activées physiquement ou chimiquement sont coatées avec des cellules cultivées ou des coupes de tissus. Les coupes de tissus congelées sont fixées à la surface du verre par liaison covalente, augmentant ainsi l'adhésion de plus de 100 fois et permettant donc d'éviter le détachement des substrats.


• Technologie BIOCHIP: ces lamelles couvre-objet sont alors découpées à l'aide d'une machine en fragments de quelques millimètres de côté (ce sont les BIOCHIPs). Ceci permet d'obtenir une dizaine de préparations de qualité homogène par lamelle pour les coupes de tissu. Dans le cas de substrats fait de cellules mises en culture on peut obtenir plusieurs milliers de BIOCHIPs par lamelle.


• Mosaïques™ de BIOCHIP: l'utilisation de plusieurs BIOCHIPs coatés avec différents substrats et disposés côte à côte dans le même puits de réaction permet d'analyser simultanément les anticorps dirigés contre plusieurs antigènes. Des profils détaillés d'anticorps peuvent donc être établis avec un moindre effort, permettant une analyse simultanée sur différents substrats. Ce procédé permet d'étudier plusieurs anticorps à partir de la même dilution de sérum.


• Technique TITERPLANE™: les échantillons ou les réactifs sont déposés sur les puits de réaction du support de réactif (TITERPLANE). Les lames à BIOCHIP sont ensuite placées sur le support de réaction. Tous les puits entrent alors en contact avec les liquides, ainsi les réactions individuelles commencent simultanément. Comme ces liquides sont confinés dans un espace clos, l'utilisation d'une "chambre humide" conventionnelle n'est donc plus nécessaire.
Lame TITERPLANE EUROIMMUN de 10 puits structurés en mosaïque

 

       
Mode Opératoire (entièrement automatisable)
       
1 Incubation avec les échantillons
  Pipetage des échantillons dilués Dépôt de la lame à l'envers sur le TITERPLANE 30'
Incubation
 
2 Lavage au PBS-Tween
   1''
Rincer
 5'
dans le bac de lavage
 
   
3 Incubation avec le conjugué
  Pipetage du conjugué couplé à la FITC Dépôt de la lame à l'envers sur le TITERPLANE  30'
Incubation
 
4 Lavage au PBS-Tween
   1''
Rincer
 5'
dans le bac de lavage
 
   
5 Inclusion et observation
    Inclusion par dépôt de la lame incubée sur la lamelle. Evaluation: lecture de fluorescence au microscope.
  1. Dépôt de la lamelle couvre objet sur le portoir en polystyrène du TITERPLANE.

2. Dépôt du milieu d'inclusion (glycérine) sur la lamelle.

 

 NB : dans le cas de l'automatisation de l'IFI, les lames sont techniquées à l'endroit de façon "traditionnelle".

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